制药工程专业毕业论文
时间：2021-10-17 10:28:53 来源：网友投稿
中国医科大学
毕 业 设 计 (论 文 )
猪心中细胞色素 C 的提取工艺研究
学
院
XX 学院 专
业
制药工程
班
级
20XX 级 X 班 学生姓名
学生姓名 学
号
12345678 指导教师
X 教授
202X 年 3 月
猪心中细胞色素 C 的提取工艺研究
摘要 目的：细胞色素 C 是一种细胞呼吸激活剂，细胞色素 C 与细胞凋亡有密切关系，它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中，以猪心为原料来提取纯化细胞色素 C 并将细胞色素 C 进行纯化。方法：取猪心在酸性条件下提取细胞色素 C 粗品后通过吸附法将细胞色素 C 进行提纯，并对比不同条件下的提取率。结论：测定其含量为 2.85%
关键词
细胞色素 C；提取；提纯
The pig heart in extraction and purification of cytochrome C
Abstract Objective：Cytochrome C is a kind of cell respiration activator, cytochrome C has close relationship with cell apoptosis, it widely exists in various kinds of animal, plant and microbe, with pig heart as raw material to extract purified cytochrome C and cytochrome C and purification.Methods：The pig"s heart was extracted under acidic conditions, and the cell pigment C was purified by adsorption method, and the extraction rate was compared under different conditions.Results：Determination of its content is 2.85%
Key words
Cytochrome C;extract ;purification
1 1 前言 细胞色素 C 溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗 [1] 。目前很多高发的疾病和难以治愈的慢性疾病都和细胞色素 C 有关。细胞色素 C 对细胞的凋亡，细胞组织的生长，对细胞器官的发育都有着很大的影响。细胞色素 C 广泛存在于人体细胞中所以细胞色素 C 对人体机能的平衡影响也非常大，因此细胞色素 C 的研究对生物学有着重大的意义。可以说细胞色素 C 的价值很高应用前景非常的广泛，细胞色素C在不仅临床急救的应用很广而且细胞色素C对很多慢性病的治疗也十分有效。
想要得到细胞色素 C 也十分简单，我们可以从动物体内提取细胞色素 C，动物心脏中含有丰富的细胞色素 C，本实验正是从猪心中提取细胞色素 C。细胞色素是呼吸链中重要的电子传递体，细胞色素包含很多种，细胞色素 C 只是细胞色素的一种，细胞色素 C 主要存在于线粒体中，需氧最多的组织及酵母细胞和心肌细胞中，细胞色素 C 的含量非常的丰富。目前来看,心血管疾病、脑组织损伤、癌症、败血症、糖尿病和神经性的疾病在全球的发病率非常高,在这些疾病中细胞色素 C 均表现出不同程度的代谢紊乱。细胞色素 C 是由两个无活性的前体分子合成的，即前细胞色素 C 和亚铁血红素 [2] 。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素 C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素 C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。细胞色素 C（Cytochrome C）是从猪心中提取的细胞呼吸激活剂，是含铁卟啉的色蛋白质 [3] 。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。细胞色素C主要作为电子载体或者氧化还原酶参与细胞的能量传递过程 [4] 。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素 C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素 C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量 [5] 。细胞色素 C 是细胞凋亡的重要信息物质之一。发展简单、快速的细胞色素 C 的检测方法对于临床检测和生物学研究具有重要意义 [6-7] 。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着非常重要的意义 [8-10] 外源性细胞色素 C 是不能进入健康细胞[11-12] 从线粒体中泄露出的细胞色素 C 有诱导细胞凋亡的作用 [13-15] 。在生物氧化过程传递电子中细胞色素 C 起到了重要的作用 [16-18] 。
细胞色素 C 的研究对现代生物药物的研究有着很重要的意义，生物制药是近几十年来研究的热门。而且细胞色素 C 在临床上应用十分广泛，在抢救患者生命
2 中也扮演者非常重要的角色。细胞色素 C 能用于各种组织细胞缺氧的治疗，比如一氧化碳中毒的患者还有心肌缺氧的患者都可以通过注射细胞色素 C 来得到及时的抢救。同时细胞色素 C 的提取工艺也非常的简单利用其易溶于酸的特性通过简单的吸附法能简单有效的得到细胞色素 C 提取物，原料的来源也非常多，动物的心脏含有非常丰富的细胞色素 C。所以细胞色素 C 的药物制品是一种非常廉价又使用效果很好的药物，非常值得研究和发展。通过本实验的研究希望能更好的利用细胞色素 C 来防治疾病。
2 材料与方法 2.1 实验材料与仪器 2.1.1 实验材料 猪心（市场购买的新鲜猪心）；2mol/L H 2 SO 4 溶液；1mol/LNH 4 OH（氨水）溶液；0.2%NaCl溶液；25%（NH 4 ）
2 SO 4 溶液：100ml溶液中含25g（NH 4 ）
2 SO 4 ，约为25摄氏度时40%的饱和度；BaCl 2 试剂（称BaCl 2 12g溶于100ml蒸馏水中）；20%三氯乙酸（TCA）溶液；人造沸石（Na 2 O·Al 2 O 3 ·xSiO 2 ·yH 2 O）：白色颗粒，不溶于水，溶于酸，选用60-80目：联二硫酸钠。
2.1.2 实验仪器 绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；722型分光光度计；玻璃柱（2.5cm*30cm)一根；烧杯不同容量若干；500ml下口瓶；量筒，移液管，玻棒，抽滤机，透析纸，滤纸，纱布，玻璃漏斗。
2.2 实验方法 2.2.1 细胞色素 C 的提取 取新鲜的猪心一颗，去除血块、肌腱和脂肪，切成条块状洗掉血液，用绞肉机将其绞碎。称取心肌碎肉，加入1到2倍量的蒸馏水搅拌均匀，用1mol/L的硫酸调整PH到4左右，在常温条件下搅拌提取两个小时，然后进行压滤，滤液用1mol/L的氨水调节PH至6.2，离心，得到提取液。滤渣再加等量蒸馏水同上方法重复提取一次，合并两次提取液。提取液加入2mol/L氨水调节PH至7.5，再在冰浴中静置沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加入10g人造沸石，搅拌吸附40分钟，静置去掉上层清液。收集吸附细胞色素C的人造沸石，再用蒸馏水洗涤三次，2g/L的氯化钠洗涤4次，再用蒸馏水洗至洗液澄清为止。过滤抽干，装入柱内用25%
3 硫酸铵溶液进行洗脱，得到洗脱液。
2.2.2 细胞色素 C 的纯化 将洗脱液加入固体硫酸铵达到45%的饱和度（相对密度1.21到1.23），使杂志蛋白析出，然后过滤。收集透明液体，然后慢慢加入20%的三氯乙酸（25ml/L，按体积计算），边加边搅拌使细胞色素C沉淀析出，离心收集沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，装入透析袋中，用常水和蒸馏水透析至无硫酸根为止，最后过滤得到细胞色素C粗品溶液。
粗品溶液通过处理好的Amberlite IRC-50(NH 4 ＋)树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，用水洗到澄清为止，再分别上柱，用0.6mol/L磷酸氢二钠-0.4mol/L氯化钠混合溶液洗脱，流速2ml/min。洗脱液用蒸馏水透析去离子，得到细胞色素C精致液。
2.3 细胞色素 C 的含量测定 本实验得到的细胞色素C是氧化型和还原型的混合物，因此在测定含量时，要加入联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型细胞色素C转变为还原型。还原型的细胞色素C水溶液在波长520mm处有最大吸收值，根据这一特性，用国产722型分光光度计选一标准品，做出细胞色素C浓度和对应的光吸吸收值的标准曲线，然后根据所测溶液的光吸收值，由标准曲线的斜率求出所测样品的含量。
3 结果与分析 3.1 细胞色素 C 提取纯化试验结果 3.1.1 细胞色素 C 提取时料液比对结果的影响 分别称取50g取绞碎后的猪心肌肉糜,用蒸馏水浸提,分别加入蒸馏水为50mL、100mL、150mL、200mL，在pH为4.0条件下30℃浸提2小时，提取液采用人造沸石吸附,（NH 4 ）
2 SO 4 洗脱，三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素C粗品。5mL蒸馏水溶解细胞色素C粗品后，520nm处测吸光值考察料液比对提取效果的影响。结果图1表明随着水量的增大吸光值越大，料液比为1:2时为最佳提取条件。
4
图1 吸光度随蒸馏水量的变化 3.1.2 细胞色素 C 提取时 PH 对结果的影响 100mL蒸馏水，温度为30℃，选择提取 pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0，浸提 2h，提取液采用人造沸石吸附，（NH 4 ）
2 SO 4 洗脱，三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素C粗品。5mL蒸馏水溶解细胞色素C粗品后，20nm处测吸光值，考察pH对提取效果的影响。图2表明PH为4.0时吸光值最大，所以PH为4.0时为最佳的提取条件。
图2 吸光度随PH的变化 3.1.3 细胞色素 C 提取时温度对结果的影响 分别称取 50g 取绞碎后的猪心肌肉糜，加入100mL 蒸馏水，分别在 25℃、30℃、35℃、和 40℃条件下，pH 为4.0，浸提 2h，提取液采用人造沸石吸附，（NH 4 ）
2 SO 4
洗脱，三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素 C 粗品。5mL蒸馏水溶00.050.10.150.20.250.30.350.40 50 100 150 200 250吸光度蒸馏水加入量0.250.260.270.280.290.30.310.322.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5吸光度PH
5 解细胞色素C粗品后，520nm处测吸光值，考察浸提温度对提取效果的影响。图3表明温度在30℃时吸光值最大，所以最佳的提取温度条件为30℃。
图3 吸光度随温度的变化 3.2 细胞色素C得率的测定 00.050.10.150.20.250.30.3520 25 30 35 40 45吸光度温度℃
6 取 1ml 标准品(80mg/ml)，稀释至 25ml，从中分别取得 0.2,0.4,0.6，0.8,1.0ml，分别放置在 5 个试管当中，每管补加蒸馏水到 4ml，并加入少许联二亚硫酸钠作为还原剂，然后在 520mm 处测得吸光值分别为 0.177,0.328,0.517,0.699,0.867。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，作出标准曲线图 4。
图 4 细胞色素 C 浓度吸光值标准曲线图 反复实验结果得知 520mm 处测平均吸光值为 0.305。据图 4 得知浓度测得得率为 2.85%
4 讨论 本次实验主要利用了细胞色素 C 在酸性条件下溶解度大，利用吸附法将细胞色素 C 吸附并提取纯化。吸附法设备简单操作方便，廉价安全，吸附洗脱过程中PH 变化小，较少引起生物活性物质失活。本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素 C，并测定其含量的操作简单方便。并且比较了不同条件下提取纯化对提取结果的影响，用最佳的方式提取并得到了细胞色素 C 纯化制品。细胞色素 C 的研究对生物学有着非常重要的意义 [19-20] 。
本次实验受到实验幻境的影响和多方面的因素，因此本次试验存在一定的误差，需要经过多次反复操作方可符合要点要求。
00.10.20.30.40.50.60.70.80.90 0.2 0.4 0.6 0.8 1吸光值细胞色素C浓度mg/ml
7 参考文献 [1]肖云.从猪心中提取纯化细胞色素 C 工艺研究[N].武汉.武汉职业技术学院.2015.2 [2]王艳杰，邓雯，张鹏飞.细胞色素 C 与细胞凋亡研究进展[J].动物医学进展，2012，（20）：15-18 [3]李六水.细胞色素 C 对庆大霉素、依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究[D].安徽 .安徽医科大学.2012.5.1 [4]付慧慧.Shewanella oneidensis 呼吸替补通路及细胞色素 c 成熟机制的研究[D].浙江.浙江大学.2016.4.1 [5]马志科.秦川牛心肌细胞色素C和辅酶Q10提取纯化及检测的研究[D].西北农林科技大学.2015.11.1 [6]尹雪花.新型纳米材料的制备及其在细胞色素 C 检测中的应用[D].湖南.湖南大学.2016.5.1 [7]赵丹，贺莉芳，刘晖，李晓飞，刘流，晏容.线粒体、细胞色素 C、Caspase与细胞凋亡[J],医学动物防治,2012，（07）：20-26 [8]吉浩宇,王小龙.早期激素性股骨头坏死过程中细胞色素 C 的作用[J].中国组织工程研究,2016，（05）：35-38 [9]韩蕊.Shewanella oneidensis MR-1 外膜细胞色素 c 介导的胞外电子传递过程研究[D].华南理工大学.2016.6.26 [10]覃芳.细胞色素 C 氧化酶的表达、纯化及其活性测定[D].湖南.湖南大学.2013.6.1 [11]叶平，宋金辉，侯连生.细胞色素 C 在盘基网柄菌细胞凋亡中的作用[J].动物学杂志，2015，（08）：50-55 [12]刘萍,丛国正,独军政,邵军军,林彤,常惠芸.细胞凋亡信号传导通路的研究进展[J]. 湖北农业科学，2013，(03)：20-23 [13]刘畅,王筠,姜丁文.内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用[J].广东医学，2012，(01)：36-40 [14]马宇洁,杨兴易,林兆奋,缪明永,张雷,宁波.大鼠心肺复苏后神经细胞线粒体通透性转换孔变化在细胞色素 C 释放中的作用[J].中华急诊医学杂志，2013，
8 (10)：11-13 [15]金苗.Shewanella oneidensis 细胞色素 C 成熟系统及亚硝酸盐抑制其延胡索酸呼吸分子机制的研究[D].浙江.浙江大学.2016 [16]高小娥.猪心中细胞色素 C 的提取与鉴定[J].南方农机，2016，(10)：23-26 [17]王佺荃,张文丽,元小冬,彭伟,骆泓洁.线粒体在细胞凋亡中的作用[J].中国医学创新，2015，(06)：30-32 [18]沈泓,林琼秋,易喻,梅建凤,庄震远,应国清.应用疏水层析法纯化 hcg 单克隆抗体[J]. 药物生物技术，2012，(05)：29-31 [19]张瑜.细胞色素 C 在硼掺杂金刚石电极上的电化学特性研究[J].天津.天津理工大学.2014 [20]唐乾,史珊珊,曹洪玉,郭相金,张涛,郑学仿.细胞色素C与NO的反应机制[J].无机化学学报，2015，(08)：23-27
9 致谢 不知不觉我在 ** 的四年学习时光过去了，在这四年中特别感谢我所有的老师，他们严谨敬业，认真负责。在本次论文实验中，实验室的整个过程都在麻烦** 老师并得到了他无私的帮助，在此特别的感谢他。同时也非常感谢实验室里所有同学的帮助。
在整个论文中，无论论文的选题、资料的搜集、实验的操作以及论文的撰写和修改，最感谢的人是指导老师朱丹丹，感谢她所有的细心指导和大力支持以及鼓励。毕业在即，感谢所有老师和同学的陪伴。
毕业在即，在今后的工作和生活中，我会铭记师长们的教诲，继续不懈努力和追求，来报答所有支持和帮助过我的人！
...